Этот международный стандарт представляет руководство по выполнению операций, которые являются общими для всех техник микробиологического испытания воды, особенно, что касается подготовки образца, питательных сред и аппаратуры. Он также описывает различные техники подсчета, имеющиеся в распоряжении и критерии их выборов. Этот международный стандарт главным образом был разработан для бактерий, дрожжей и плесеней. Некоторые аспекты могли бы быть применены к вирусам и паразитам.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные документы необходимы для применения этого документа. Для датированных ссылок, только указанное издание. для плавающих ссылок применяют последнее издание ссылочного документа, включая любые поправки.
3 Принципы
общий принцип этих методов состоит из посева известного объема образца воды в жидкую или твердую питательную среду. предполагается, что после инкубации, микроорганизмы, присутствующие там размножаются, давая в результате либо колонию видимую непосредственно на твердой среде, или изменения в наблюдаемых свойствах жидкой среды. Выбор конкретного метода зависит не только от природы микроорганизмов, которые стремились там найти, но и от воды, и причины исследования.
4 Общие положения
Равномерность температуры и времени( инкубации) Включает в себя диапазоны температур и времени во время инкубации или хранения, которые подходят для предполагаемых целевых организмов, и если не указано иное в конкретных стандартах.
Температура хранения: (-70Ђ10)®С; (-20Ђ5)®С; (5Ђ3)®С
Температура инкубации: (22Ђ2)®С; (36Ђ2)®С
Температура стерилизации: (115Ђ3)®С; (121Ђ3)®С; (170Ђ10)®С
Время инкубации: (21Ђ3)часа; (44Ђ4)часа; (68Ђ4)часа
Другая температура и время может быть установлено отдельно для определённых методов если необходимо.
Верхняя граница температуры инкубации должна быть очень строга (она может иметь большое влияние на рост). Нижняя граница может быть нарушена на короткое время, например во время открытия дверцы термостата, но восстановление температуры должно быть быстрым.
Допуски на объемы и массы: если не указано иное, принятый диапазон любого измерения указывается значение Ђ5?
5 Растворители и питательные среды
5.1 Общее
5.1.1. Условия качества
Использовать составляющие единого качества и аналитического класса химических веществ для подготовки питательных средств. других химических классов могут быть использованы при условии, что они могут быть доказанными, что могут воспроизвести те же результаты. альтернативно, обезвоженные коммерческие питательные среды или разбавители могут быть использованы. Строго следить за инструкцией производителей.
Использовать дистиллированную или деминерализованную воду, которая является свободным от веществ, которые могут влиять на рост микроорганизмов под воздействием условий испытаний. вода должна соответствовать требованиям ISO3696: 1987, 3 степени
Если не указано иное, ингредиенты добавляются в объем воды вместо того, чтобы доводить до определенного объема, как обычно в подготовке микробиологических культуры питательных сред
если не указано иное, указанные ингредиенты добавляют к объему воды вместо того, чтобы доводить до определенного объема, что является нормальной практикой в подготовке микробиологической питательной среды.
Перед использованием проверьте качество сред, разбавителей и фильтров, например, следуя процедурам, описанным в ISO 7704, ISO / TS 11133-1 или ISO / TS 11133-2
5.1.2 Стерилизация
Распределите разбавители и питательные среды в контейнерах, пригодных для стерилизации в автоклаве. В большинстве случаев, достаточна стерилизация при температуре (121 Ђ 3) ® С в течение 15 мин. Тем не менее, иногда может потребоваться другое время и температура, и подробности приведены в каждом отдельном Стандарте.
Кроме того,удалениемикроорганизмов с термолабильных веществ, может быть осуществленно путем фильтрации через фильтр с размером пор 02 мкм, если указано производителем как пригодные для "стерилизации"
.2 Разбавители
Разбавители, приведенные в этом подразделе широко используются в водной микробиологии. Однако этот перечень не является исчерпывающим, и могут быть использованы другие подходящие разбавители.
После подготовки, разлить каждый раствор в бутылки и стерилизовать, например, в автоклаве при 121 (Ђ 3) ® С в течение 15 мин. В качестве альтернативы, разбавитель может быть асептически разлит после стерилизации. Хранить при комнатной температуре или в холодильнике при (5 Ђ 3) ® С в течение не более 6 месяцев. Если разбавитель показывает любое изменение его нормального вида, уберите его.
ISO 8199:2011
5.2.1 солевой раствор
состав:
хлорид натрия (NaCl), 8,5gr
воды (см 5.1.1) 1000ml
подготовка
растворения ингредиентов в воде, при необходимости при нагревании. Отрегулируйте рН добавлением раствора гидроксида натрия [C (NaOH) = 1 моль / л] так, чтобы после стерилизации (см 5.1.2), это будет соответствовать 7,0 Ђ 0,5 при температуре 25®С
5.2.2 пептон разбавителя
состав
ферментативный перевар казеина (пептон) 1,0g
воды (см 5.1.1) 1000ml
Подготовка
Растворения ингредиентов в воде, при необходимости при нагревании. Отрегулируйте рН добавлением раствора гидроксида натрия [C (NaOH) = 1 моль / л] так, чтобы после стерилизации (см 5.1.2), он соответствовал 7,0 Ђ 0,5 при температуре 25®С
5.2.3 Пептон солевой раствор
Состав
ферментативный перевар казеина (пептон) 1,0 гр
хлорид натрия (NaCl), 8,5gr
воды (см 5.1.1) 1000ml
Подготовка
Растворять ингредиенты в воде, при необходимости при нагревании. Отрегулируйте рН добавлением раствора гидроксида натрия [C (NaOH) = 1 моль / л] так, чтобы после стерилизации (см 5.1.2), это будет соответствовать 7,0 Ђ 0,5 при температуре 25ЊC
5.2.4 Раствор Рингера четверть силы
состав
хлорид натрия (NaCl), 2,25g
хлорид калия (KCl) 0,105g
хлорид кальция (безводный) (CaCl2) 0,12g
гидрокарбонат натрия (NaHCO 3) 0,05g
воды (см 5.1.1) 1000ml
подготовка
растворения ингредиентов в воде, при необходимости при нагревании. Доводят рН добавлением раствора гидроксида натрия [C (NaOH) = 1 моль / л], так что, после стерилизации (см 5.1.2), это будет соответствовать 7,0 Ђ 0,5 при температуре 25ЊC
5.2.5 Фосфатный буферный раствор
а) раствор фосфата
состав
калия дигидрофосфат ортофосфат (КН2РО4) 34g
воды (см 5.1.1) до 1000 мл
подготовка
растворить калия дигидрофосфат ортофосфат в 500 мл воды, довести рН до значения 7,2 Ђ 0,2 добавлением раствора гидроксида натрия [C (NaOH) = 1 моль / л] или соляной кислоты [C (HCl) = 1 моль / л]. добавить воды до 1000 мл.
Если необходимо хранить раствор, стерилизовать (5.1.2) перед хранением
б) раствор хлористого магния
состав
хлорид магния (MgCl 2) 38g
воды (см 5.1.1) 1000ml
Альтернативно, могут быть использованы сульфата магния (MgSO 4 * 7H2O) с
эквивалентной массой (99 г)
подготовка
растворения хлорида магния в воде. Если раствор нужно хранить, стерилизовать (5.1.2) перед хранением.
в) окончательный раствор:
состав;
раствор фосфата (а) 1,25ml
раствор хлорида магния (б) 5,0ml
воды (см 5.1.1) 1000ml
подготовка
добавить раствор фосфата (а) и раствора хлорида магния (б) к воде, соответствующего объема и стерилизовать (5.1.2). конечное значение рН должно соответствовать 7 Ђ 0,2 на 25Њ С
5.3 Питательные среды
когда банка обезвоженной среды (химикатов) открыта, датируйте контейнер и укажите максимальное время хранения.
В целом, большинство питательных сред после стерилизации в герметичных контейнерах может храниться удовлетворительно в течение нескольких месяцев при комнатной температуре при условии, что они хранятся в темноте и остаются закрытыми. Среды, разлитые в асептических условиях, могут храниться на (5 Ђ 3) ® С, в течение 1 месяца или дольше, если так решено. Перед использованием проверьте их тщательно на загрязнения, чрезмерного высушивания, или на другие доказательства ухудшения свойств. Большинство реагентов лучше всего хранить при температуре (5 Ђ 3) Њ C. Использование питательных сред поставляемых предварительно разлитыми, необходимо в соответствии с инструкцией производителя.
Предварительно охладить среду, до 45ЊC или 50ЊC, если добавки термочувствительны, то они должны быть добавлены после автоклавирования
6 Стерилизация аппаратуры и посуды
Устройства и изделия, которые не поставляются стерильными, стерилизуются одним из следующих способов:
а) в печи, на (170 Ђ 10) ® С в течение не менее 1 ч (без учета времени предварительного нагрева);
б) в автоклаве, в (121 Ђ 3) ® С в течение не менее 15 мин.
Если мембранные фильтры не являются стерильными, стерилизовать их перед использованием в соответствии с инструкциями изготовителя
7 Образцы
7.1 ОТБОР ПРОБ
Отбирать образцы в соответствии с ISO 19458
7,2 Подготовка испытуемого образца
перед исследованием, перемешать образец энергичным встряхиванием перемешиванием, чтобы достичь равномерного распределения микроорганизмов и, в зависимости от характера воды и ожидаемого содержание микроорганизмов, делать какие-либо разведений необходимые на данном этапе.
В случае посева в чашки, можно использовать десятичные разведения. Для мембранной фильтрации (с меньшей площадью), рекомендуется делать меньшие шаги разбавления.
Для десяти-кратного разведения, измеряют 90ml или 9ml разбавителя в стерильные бутылки или пробирки для разбавления. Кроме того, объемы разбавителя, предварительно простерилизованные, могут быть использованы в бутылках с винтовой резьбой. Один или больше десятикратных разведений могут быть сделаны путем добавки одного объема пробы воды к девяти объемам разбавителя. Смешайте тщательно раствор (чистой пипеткой или с помощью механических средств) и добавить один объем этого раствора, к девяти объемам разбавителя. Эти этапы повторяются столько раз, сколько требуется. Подготовьте достаточно объемов каждого разведения на все испытания, чтобы выполнять их на образце.
Для других, чем в десять раз разведений, объем разбавителя к объему образца должны быть соответствующим образом скорректированы, / могут быть приняты различные подходы, то есть 3 или 4-кратное серию разбавления, или десятичную серию разбавления из которых оба 10 мл и объемы 30ml фильтруют. Четырехкратное разведение могут быть сделаны, как описано выше для десятикратного разведения, исключая того, что, в этом случае, один объем пробы воды, смешивают с тремя объемами разбавителя.
Если концентрация организма-мишени, как ожидается, будет высокой, можно использовать шаги разведение стократные.
Для общего руководства по подготовке десять разведений, ИСО 6887-1
8. Подсчет после посева тестируемого количества пробы в ( или на) твердую среду
8.1 Принцип
Тестируемое количество пробы воды или разведения засеивают или прямо, или концентрируя на мембране, на поверхность определенной твердой культуральной среды, или в плавленую среду таким образом, что при инкубации микроорганизмы формируют колонии или на, или в среде.
Для практических целей считается, что каждая колония образована одним микроорганизмом, или скоплением микроорганизмов представленных в тестируемой порции на момент посева. Приняв во внимание объем тестируемого количества и число образовавшихся колоний результат может быть, следовательно, выражен как число колоние образующих единиц (КОЕ) cfu или колоние образующих частиц (КОЧ)cfp в данном объеме образца, например в 1 мл. или 100 мл.
8.2 Процедура
8.2.1 Общее
Три главных процедур может быть использовано для посева на твердую среду
) Техника заливки чашек
Тестируемое количество смешивается со средой, которая была предварительно расплавлена и охлаждена до температуры близкой к застыванию, после инкубации колонии которые развиваются в и на поверхности среды подсчитываются
) Техника посева растиранием
Тестируемое количество растирается на сухой поверхности агаровой среды и после инкубации колонии которые образовываются на поверхности подсчитываются.
) Техника мембранной фильтрации
Тестируемое количество проходит через мембранный фильтр, который задерживает искомые микроорганизмы. Мембрана затем переносится на агаровую среду или на адсорбирующую подкладку насыщенную жидкой или смоченной водой сухой питательной средой. При инкубации колонии образуются на поверхности мембраны. Как альтернатива, для некоторых организмов, таких, например, как анаэробные, мембрана, может быть размещена, поверхностью вниз, на чашку Петри, и покрыта расплавленной агаровой средой.
8.2.2 Выбор техники зависит от нескольких факторов, включая физические и химические характеристики воды, так же как и от природы искомых микроорганизмов, их возможной концентрации эффективности восстановления после стресса или (sub-lethally умирающие), поврежденные микроорганизмы, точность испытания и требования чувствительности. Указания даны в 8.2.3.1, 8.2.4.1, 8.2.5.1 об объемах пробы воды. Что может быть использовано для каждый техники и предела обнаружения (limits of detection) обсуждаются в главе А.2. Точность accuracy техники также обсуждается в главе А.2. Требования правил может также влиять на выбор техники, чтобы использовать по указанию, например точность требуется, либо же отсутствие или присутствие какого-то организма в определенном тестовом количестве может быть достаточным.
8.2.3
Техника заливки чашек
8.2.3.1 Тестовая порция. Тестовое количество
Объем испытательного количества пробы, или разведения пробы, может меняться между 0,1 и 5 мл., в зависимости от размера чашки Петри и объема использованной среды, разведение должно быть выбрано так, чтобы ожидать число типичных колоний образовано на чашке в диаметре 90мм - 100мм является между 10 и 150. Общее число колоний на чашке типичных и не типичных должно быть меньше чем 300 смотри ISO 7218 Заметьте однако, что общее число подсчитываемых колоний зависит от размера колоний и число может быть уменьшено для больших колоний.
8.2.3.2 Посев
Расплавьте среду соответственно в кипящей воде, или каким-то другим подходящим способом, (например соответствующий воздушный инкубатор, автоклавирование текущим паром или микроволновая печь, если комбинация время нагревания/температура валидирована для приготовления среды) избегайте чрезмерного нагревания и извлеките ее сразу, как только она расплавиться. Поместите расплавленную среду в водяную баню при (45Ђ1)?С на достаточное время таким образом, чтобы среда приобрела эту температуру. Предпочтительно не держать растопленную среду более 4 часов. Не растапливать агар больше чем один раз.
Приготовьте и поместите чашки Петри как требуется. Сделайте все необходимые разбавления в соответствии с 7.2. Распределите после тщательного перемешивания тестовые объемы в чашки. Извлеките каждую пробирку или колбочку по очереди из водяной бани, просушите снаружи пробирку или колбочку и профламбируйте горлышко. Добавьте среду в каждую чашку Петри без разбавления, минимизируя и избегая теплового удара для испытуемой пробы. Перемешайте осторожно так, чтобы получить равномерное распределение микроорганизмов. Обычно используется 15 мл среды для тестового количества 1 или 2 мл пробы. Для больших тестовых количеств подберите концентрацию среды соответственно. Оставьте чашки охлаждаться на горизонтальной поверхности, чтобы агар затвердел. Как только агар застынет термостатируйте чашки в соответствии с 8.2.6
Примечание система приготовления агара и дозатор разлива может быть полезен в лабораторном анализе при большом числе проб
8.2.4
Техника посева мазком
8.2.4.1. Тестовое количество
Для чашки Петри диаметром между 90 мм и 100 мм, объем тестового количества пробы или разведения от пробы, должно быть от 0,1 мл до 0,5 мл. Выберите разведение таким образом, чтобы ожидать число образованных типичных колоний между 10 и 150. Общее число колоний на чашке (типичных и нетипичных) должно быть меньше чем 200. Заметьте однако, что общее число подсчитанных колоний зависит от размера колоний и число может быть уменьшено в случае больших колоний.
8.2.4.2 Посев
Подготовьте и подпишите чашки, каждая из них содержит около 15 мл культуральной среды. Подсушите поверхность среды перед использованием (если необходимо). Переместите пипеткой тестовое количество на поверхность среды, и размажьте по поверхности стерильным шпателем или механическим устройством. После впитывания посева термостатируйте в соответствии с 8.2.6
Для сушки чашек могут быть полезны следующие положения
- степень влажности среды важно, потому что оптимум роста бактерий зависит от условий влажности "в" и "на" среде. Обширная потеря влажности может вести, например, к возрастанию концентрации ингибиторов на селективной среде, и уменьшению водной активности на поверхности среды.
- когда бактерии, которые не расползаются, быстро растут и чашки выглядят сухими после подготовки (подогрева) в термостате, обстоятельства в этом случае таковы, что сушка не всегда необходима, в этом случае сушка может быть исключена, ибо она только увеличивает вероятность заражения чашек и потерю влажности, которая не является необходимой.
- выберите температуру и время сушки таким образом, чтобы вероятность заражения держалась на таком низком уровне насколько это возможно, и так, чтобы нагревание не создавало негативного эффекта на качество среды. Время сушки зависит от степени в которой конденсат представлен в чашке Петри, но должен быть коротким насколько это возможно.
Для того, чтобы избежать заражения, и если чашки не сушатся в ламинарном шкафу, чашки должны всегда подсушиваться поверхностью среды, которая должна быть засеяна повернутой вниз.
На практике чашки должны подсушиваться помещенные агаровой поверхностью вниз с полуоткрытыми крышками в термостате, при температуре между 25?С и 50?С. Сушите чашки пока капли исчезнут с поверхности крышек. Не сушите дальше. Агаровые чашки могут также сушиться (также как было описано выше) в ламинарном шкафу при комнатной температуре от 30 до 60 минут или в течении ночи при комнатной температуре с накрытыми крышками
8.2.5 Техника фильтрации через мембраны
8.2.5.1 Часть пробы для испытания (Количество тестируемого материала)
Максимальный объем исследуемой пробы зависит от фильтруемости пробы воды и используемых мембран,. Этот метод подходит для вод, которые содержат мало частиц или коллоидной(например железо) взвеси, например, питьевой воды. через мембрану среднего размера пор 0,45 мкм, можно отфильтровать несколько литров такой воды, и так достичь высокого уровня чувствительности теста. Для некоторых организмов (например, Legionella), однако, может быть необходимым фильтрация через мембрану со средним размерам пор 0,2 мкм.
Объем испытательного образца или разведения, должен быть выбран таким образом, чтобы ожидаемое число типичных колоний, образованных на мембране 47 мм или 50 мм в диаметре, находилось примерно между 10 и 100. Общее число колоний на фильтре (типичной и нестандартных) должно быть меньше, чем приблизительно 200. отметьте, однако, что общее количество колоний зависит от размера колоний, и количество может быть уменьшено для больших колоний.
8.2.5.2 Фильтрация
Подключите устройство стерильной фильтрации с источником вакуума. Поместите стерильный мембранный фильтр, сеткой на верхней стороне, на пористый диск основания фильтра, держа его с краю плоским кончиком стерильного пинцета. Расположите стерильную воронку надежно на фильтре. Пипеткой, или, одним из следующих, залить в воронку (с вакуумным краном выключено):
а) известный объем образца, или разбавление его, тщательно перемешивают (не менее 10 мл);
б) содержание колбы или флакона, содержащий тест и достаточную по объему, чтобы разбавителем довести общий объем, по меньшей мере, до 10 мл;
в) по меньшей мере, 10 мл разбавителя, в которую непосредственно, добавляют с помощью пипетки анализируемую пробу, и смешивают пипетированием.
Открыть кран и создать достаточно вакуума (около 70 кПа) для фильтрации воды через мембрану. Как только образец был отфильтрован Закройте кран. Может быть целесообразным, чтобы промыть воронку путем фильтрации от одного до трех раз от 10 мл до 30 мл стерильного разбавителя, когда фильтр находится на своем месте.
8.2.5.3 Перенос мембраны
Удалить воронку (Убедитесь, что кран закрыт, прежде чем делать это), и перенести мембрану стерильным пинцетом на одно из следующих мест, гарантируя, что нет пузырьков воздуха в пространстве между мембраной и средой:
а) агар в чашке Петри:
б) стерильные абсорбирующей прокладки предварительно насыщенные жидкой средой, или обезвоженной средой предварительновосстановленной стерильной водой, в чашке Петри (чтобы избежать сплошного роста, слейте излишки среды, предпочтительно до размещения мембраны на подушечке);
в) чашку Петри или на небольшой слой агаровой среде в чашке Петри, образованный расплавленной агаровой средойпри (45 Ђ 1) o C.
Для разных объемов того же образца, воронка может быть повторно использована без дезинфекции при условии, что наименьший объем и (или) самый разбавленный образец фильтруют в первую очередь. Для фильтрации другого образца, либо использовать отдельный стерильный аппарат, или применять дезинфекцию воронку, например пламенем. В качестве альтернативы, следуйте инструкциям производителя для дезинфекции
8.2.6 Инкубация
Перевернитезасеянныечашки и разместите их либо в термостате или в водонепроницаемом контейнере на водяной бане. При необходимости, упаковать чашки в пленку (полиэтиленовые мешочки), чтобы предотвратить высыхание среды (например, когда используется вентилятор для инкубатора). Чашки, содержащие мембраны на впитывающих прокладки должны быть размещены (не перевернутые) в воздушном или водной герметичном контейнере, чтобы предотвратить высыхание среды, если это необходимо. Не делать стопку выше, чем 6 чашек Петри, чтобы быть уверенным, что все чашки достигают температуры инкубации достаточно быстро.
Выберите продолжительность и температура инкубации как требует стандартный метод, так как они зависят от микроорганизма или группы микроорганизмов, Инкубационный период можетосуществляться в два этапа, а именно:
Предварительная инкубация переменной длительности, например от 2 ч до 4 ч при более низкой температуре (например, от 25 ® С до 30 ® С), может быть использован для обеспечения реанимации шокированных (поврежденных) организмов, а затем более длительного периода инкубации в обычной температуре для искомых организмов. Изменение может быть осуществлено либо путем перевода в другой инкубатор или водяную баню, или с помощью устройства, в котором температура автоматически изменяется после определенного времени. В идеале нужно поместить все чашки в инкубатор или водяную баню одновременно.
Кроме того, мембраны могут инкубироваться в течение ограниченного периода (например, 2 ч или 4 ч) на реанимационной среде, и затем быть перенесены в другую среду, которая является , обычно селективным для дальнейшей инкубации.medium, which is usually selective, for further incubation.
8.3 Подсчет
8.3.1 Общие принципы
Исследовать чашки или мембраны сразу же после инкубации. Если это не возможно, они могут храниться при (5 Ђ 3) o C в течение коротких периодов (например, несколько дней) при условии, что это не влияет на число, внешний вид или последующее подтверждение колоний.
8.3.2 Колонии, которые должны быть подсчитаны и подтверждены
Для "общего" подсчета подсчитывает на неселективной среде все колонии. С селективных и дифференциальных сред, только те колонии, которые показывают характерный внешний вид организма который стремятся определить. Увеличение может быть использовано (если не указано иное) когда размер колонии мал и / или, когда ее иначе трудно отличить от других колоний и частиц. В целом это необычно для такого подсчета чтобы указать организмы, принадлежащие только одной таксономической группы, но на практике это несоответствие может быть принято и результаты могут быть выражены как предварительные. Для более точного определения характеристик, необходимы подтверждающие тесты.
Это может быть неосуществимо, однако, когда есть многочисленные колонии, чтобы подтвердить идентичность всех их. В таких случаях, изучить все типичные колонии на выбранной площади чашки или мембраны (см также 8.4.3)
8.4 Подсчет результатов
8.4.1 Принцип
Большая часть этого подпункта была взята из ISO7218: 1996 / Amd1: 2001.
Методы подсчета, определенные ниже, учитывают, что случаи, наиболее часто встречающиеся при испытании, проводят в соответствии с методом хорошей практики лаборатории. Редкие отклонения, которые в особых случаях может возникнуть (например, значительное расхождение между числом колоний на двух чашках с тем же разведением или очень различным соотношением к массе коэффициента разбавления между чашками двух последовательных разведений) и, следовательно, необходимо, чтобы результаты, полученные из подсчета, были интерпретированы, рассмотрены или даже отвергнуты, квалифицированным микробиологом.
8.4.2 Общий случай
Расчет результатов, приведенных в данном подпункте можно использовать в тех случаях, когда общее количество колоний на чашках составляет от 10 до 200 (методика мазков-растирания, и методы мембранной фильтрации) или от 10 до 300 (техниказаливки чашек), и где число типичных колоний между 10 и 150 (растирания и техника заливки чашек) или между 10 и 100 (техника мембранной фильтрации).
Поскольку каждая колония, как предполагается, возникла из одного микроорганизма или от одного агрегата микроорганизмов, результат выражается как число колониеобразующих единиц (КОЕ) или колониеобразующих частиц (CFP) в указанном опорном объеме образца (как правило, 100 мл или 1 мл) по уравнению (1)
Cs=Z/Vtot*Vs
где
Cs является оценкой количества КОЕ или CFP в опорном объема Vs образца;
Z представляет собой сумму колоний, подсчитанных на пластинах или на мембранах, полученных из разведения d1, d2, ... di, или полученные из отдельных объемов испытательного участка (образец или разведение);
Vsявляется ссылкой на выбранный объем, которым выражаютконцентрацию микроорганизмов в образце;
Vtotэто - вычисленный общийобъем из исходного образца, засеянного в чашках, перечисленных при испытании. Vtot либо сумма отдельных объемов от навески (пробы или разбавления) или рассчитывается по формуле (2)
2) Vtot = (n1*V1*d1)+(n2*V2*d2)+...+(ni*Vi*di)
где
Vtotявляется рассчитываемым общим объемом исходного образца, который включен в перечислении чашек
n1, n2, ni это число подсчитанных пластин для разбавления d1, d2, di
V1, V2, VI, анализируемый объем используемый с разбавлением d1, d2, di
d1, d2, di это разбавление для испытательного объема V1, V2, Vi, (d = 1 для неразведенном образце, d = 0,1 в течение десяти-кратного разведения, и т.д.).
ПРИМЕЧАНИЕ 1, полученный таким образом конечный результат зависит от средневзвешенного подсчета с каждой чашки.
Если не указано иное, округлить расчетный результат до двух значащих цифр при представлении окончательных результатов.
Для того чтобы сделать это, если третий знак меньше 5 не изменяют предшествующую цифру, если третий знак больше или равен 5, увеличивают предшествующую цифру на одну единицу.
Результат выражают в виде числа предпочтительно между 1,0 и 9,9, умноженное на соответствующую степень 10, или целого числа с двумя значащими цифрами.
Пример расчета для техники заливки, или мазков-растирания в чашках Петри (подсчитаные в двух экземплярах) выглядит следующим образом
EXAMPLE 1
if the volume of the test solution used (V i, )is 1 ml, and the following counts are obtained at the respective dilution:
разбавление
подсчет
10?2
10?3
81 colonies and 97 colonies
9 colonies and 15 colonies
ПРИМЕР 1
если объем испытуемого раствора использовали (V I,) составляет 1 мл, а следующие отсчеты получаются при соответствующей разбавления:
разбавление
подсчет
10?2
10?3
81 colonies and 97 colonies
9 colonies and 15 colonies
Затем:
Z = 81 + 97 + 9 + 15 = 202
Vtot = (2 * 1 * 0,01) + (2 * 1 * 0,001) = 0,022
и если Vs составляет 1 мл:
Cs = 202/0,022 * 1 = 9 182
Затем, после округления: Cs = 9,2 * 10Ё КОЕ / мл (или CFP / мл)
Пример расчета для техники мембранной фильтрации (перечисленных в единственном числе) состоит в следующем
Пример 2
Анализируемый объем V i,
подсчет
100 ml
10 ml
82 colonies
11 colonies
Таким образом
Z= 82+11=93
Vtot =(1 * 100 * 1)+(1 * 10 * 1)=110
И, если Vs - 100 ml:
Cs=93/110 *100=84 cfu/100 ml (or cfp/100 ml)
Z = 82 + 11 = 93
Vtot = (1 * 100 * 1) + (1 * 10 * 1) = 110
и если Vs 100 мл:
Cs = 93/110 * 100 = 84 КОЕ / 100 мл (или CFP / 100 мл)
желательно, чтобы сообщить о результатах такого подсчета колоний вместе с пределами доверительных 95%, что может быть получено путем применения следующих уравнений (см Ссылка [5]):
1) Когда Z™ 20, конечный результат с 95% доверительный интервал (CI) определяется уравнением (3):
CsЂ95%Cl=(ZЂ2vZ/Vtot )* Vs = (Z/Vtot Ђ 2vZ/ Vtot)*Vs, где символы имеют указанные выше значения.
1) когда Z <20, эффект увеличения перекоса (асимметрии) распределения Пуассона на доверительными пределами приблизительно учтены путем добавления небольших исправлений, включенных в уравнении (4):
Верхний и нижний 95% Cl = {( Z+2 Ђ 2vZ+1)/Vtot }* Vs
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Последнее уравнение дает среднее и 95% Cl даже для Z = 0, которое может ввести в заблуждение.